Молекулярные методы детекции позволяют получать большие объёмы нуклеиновых кислот путём амплификации следовых количеств, обнаруженных в образцах. Хотя это и способствует повышению чувствительности детекции, это также создаёт риск загрязнения вследствие распространения аэрозолей амплификации в лабораторной среде. При проведении экспериментов следует принимать меры для предотвращения загрязнения реагентов, лабораторного оборудования и рабочего пространства, поскольку такое загрязнение может привести к ложноположительным (или ложноотрицательным) результатам.
Чтобы снизить вероятность заражения, необходимо постоянно соблюдать правила надлежащей лабораторной практики. В частности, необходимо принять меры предосторожности в отношении следующих моментов:
1. Обращение с реагентами
2. Организация рабочего пространства и оборудования
3. Рекомендации по использованию и очистке обозначенного молекулярного пространства
4. Общие советы по молекулярной биологии
5. Внутренний контроль
6. Библиография
1. Обращение с реагентами
Перед открытием пробирок с реагентами кратковременно центрифугируйте их, чтобы избежать образования аэрозолей. Разлейте реагенты по аликвотам, чтобы избежать многократного замораживания-оттаивания и загрязнения основных растворов. Чётко маркируйте и датируйте все пробирки с реагентами и реакционными смесями, а также ведите журналы регистрации партий и номеров партий реагентов, использованных во всех экспериментах. Пипетируйте все реагенты и образцы, используя фильтрующие наконечники. Перед покупкой рекомендуется уточнить у производителя, подходят ли фильтрующие наконечники к используемой марке пипетки.
2. Организация рабочего пространства и оборудования
Рабочее пространство должно быть организовано таким образом, чтобы обеспечить однонаправленный поток работ – от чистых зон (до ПЦР) к грязным зонам (после ПЦР). Следующие общие меры предосторожности помогут снизить вероятность загрязнения. Необходимо выделить отдельные помещения или, как минимум, физически изолированные зоны для: приготовления мастер-микса, выделения нуклеиновых кислот и добавления ДНК-матрицы, амплификации и работы с амплифицированным продуктом, а также анализа продукта, например, гель-электрофореза.
В некоторых случаях наличие четырёх отдельных комнат затруднительно. Возможный, но менее желательный вариант — приготовление мастермикса в изолированной зоне, например, в ламинарном шкафу. В случае вложенной ПЦР-амплификации приготовление мастермикса для реакции второго раунда следует осуществлять в «чистой» зоне для приготовления мастермикса, но инокуляцию первичным ПЦР-продуктом следует проводить в комнате для амплификации и, по возможности, в выделенной изолированной зоне (например, в ламинарном шкафу).
Для каждой комнаты/зоны необходим отдельный набор чётко маркированных пипеток, наконечников для фильтров, штативов для пробирок, вортексов, центрифуг (при необходимости), ручек, стандартных лабораторных реагентов, лабораторных халатов и коробок с перчатками, которые будут находиться на соответствующих рабочих местах. При перемещении между выделенными зонами необходимо мыть руки, а также менять перчатки и халаты. Реагенты и оборудование нельзя перемещать из грязной зоны в чистую. В случае крайней необходимости, если реагент или оборудование необходимо переместить обратно, их необходимо сначала продезинфицировать 10% раствором гипохлорита натрия, а затем протереть стерильной водой.
Примечание
10% раствор гипохлорита натрия необходимо готовить ежедневно. При использовании для дезинфекции следует соблюдать минимальное время контакта 10 минут.
В качестве альтернативы можно использовать имеющиеся в продаже продукты, одобренные как разрушающие ДНК средства для дезинфекции поверхностей, если местные рекомендации по безопасности не допускают использования гипохлорита натрия или если гипохлорит натрия не подходит для дезинфекции металлических частей оборудования.
В идеале сотрудники должны придерживаться принципа однонаправленного рабочего потока и не переходить из грязных зон (после ПЦР) в чистые зоны (до ПЦР) в один и тот же день. Однако бывают случаи, когда это неизбежно. В таких случаях сотрудники должны тщательно мыть руки, менять перчатки, использовать назначенный лабораторный халат и не вносить в помещение оборудование, которое они захотят вынести, например, лабораторные журналы. Такие меры контроля следует особо подчеркнуть при обучении персонала молекулярным методам.
После использования рабочие поверхности следует очищать 10% раствором гипохлорита натрия (а затем стерильной водой для удаления остатков отбеливателя), 70% раствором этанола или проверенным коммерчески доступным деконтаминантом, разрушающим ДНК. В идеале следует установить ультрафиолетовые (УФ) лампы для проведения деконтаминации облучением. Однако использование УФ-ламп следует ограничить закрытыми рабочими зонами, например, шкафами безопасности, чтобы ограничить воздействие УФ-излучения на сотрудников лаборатории. Для обеспечения эффективной работы ламп, пожалуйста, соблюдайте инструкции производителя по уходу за УФ-лампами, вентиляции и их очистке.
При использовании 70% этанола вместо гипохлорита натрия для завершения дезактивации потребуется облучение УФ-излучением.
Не очищайте воронку и центрифугу гипохлоритом натрия. Вместо этого протрите их 70% раствором этанола и обработайте УФ-излучением или используйте коммерческий дезактиватор, разрушающий ДНК. В случае пролития обратитесь к производителю за дополнительными рекомендациями по очистке. Если это разрешено инструкциями производителя, пипетки следует регулярно стерилизовать в автоклаве. Если пипетки невозможно обработать в автоклаве, достаточно очистить их 10% раствором гипохлорита натрия (с последующим тщательным протиранием стерильной водой) или коммерческим дезактиватором, разрушающим ДНК, с последующим воздействием УФ-излучения.
Регулярная очистка высокопроцентным раствором гипохлорита натрия может со временем повредить пластиковые и металлические поверхности пипеток. Перед использованием ознакомьтесь с рекомендациями производителя. Всё оборудование необходимо регулярно калибровать в соответствии с рекомендованным производителем графиком. Специально назначенное лицо должно отвечать за соблюдение графика калибровки, ведение подробных журналов и наличие на оборудовании чётких этикеток с информацией о сервисном обслуживании.
3. Рекомендации по использованию и очистке обозначенного молекулярного пространства
Пре-ПЦР: Аликвотирование реагентов/приготовление мастер-микса: Это должно быть самое чистое помещение из всех, используемых для подготовки молекулярных экспериментов, и в идеале это должен быть отдельный ламинарный бокс, оборудованный УФ-лампой. В этой зоне нельзя работать с образцами, выделенными нуклеиновыми кислотами и амплифицированными продуктами ПЦР. Реагенты для амплификации следует хранить в морозильной камере (или холодильнике, в соответствии с рекомендациями производителя) в том же специально отведенном месте, в идеале рядом с ламинарным боксом или зоной пре-ПЦР. Перчатки следует менять каждый раз при входе в зону пре-ПЦР или ламинарный бокс.
Зону предварительной ПЦР или ламинарный бокс необходимо очищать до и после использования следующим образом: протрите все предметы в боксе, например, пипетки, контейнеры с наконечниками, вортекс, центрифугу, штативы для пробирок, ручки и т. д., 70% этанолом или коммерческим деконтаминантом, разрушающим ДНК, и дайте высохнуть. В случае использования закрытой рабочей зоны, например, ламинарного бокса, облучайте бокс ультрафиолетом в течение 30 минут.
Примечание
Не подвергайте реагенты воздействию ультрафиолетового излучения; вносите их в бокс только после его очистки. При проведении ПЦР с обратной транскрипцией может быть полезно протереть поверхности и оборудование раствором, разрушающим РНКазы при контакте. Это поможет избежать ложноотрицательных результатов, связанных с ферментативной деградацией РНК. После деконтаминации и перед приготовлением мастер-микса следует ещё раз сменить перчатки, после чего бокс готов к использованию.
Пре-ПЦР: экстракция нуклеиновой кислоты/добавление матрицы:
Нуклеиновую кислоту необходимо выделять и обрабатывать во второй выделенной зоне, используя отдельный набор пипеток, наконечников для фильтров, штативов для пробирок, чистые перчатки, лабораторные халаты и другое оборудование. Эта зона также предназначена для добавления матрицы, контролей и линий тренда в пробирки или планшеты с мастер-миксом. Во избежание загрязнения анализируемых образцов выделенных нуклеиновых кислот рекомендуется менять перчатки перед работой с положительными контролями или стандартами и использовать отдельный набор пипеток. Реагенты ПЦР и амплифицированные продукты нельзя пипетировать в этой зоне. Образцы следует хранить в выделенных холодильниках или морозильниках в той же зоне. Рабочее пространство для образцов следует очищать так же, как и пространство для мастер-микса.
Пост-ПЦР: амплификация и обработка амплифицированного продукта
Это выделенное пространство предназначено для постамплификационных процессов и должно быть физически отделено от зон пре-ПЦР. Обычно в нём находятся термоциклеры и платформы для анализа в реальном времени, а в идеале – ламинарный шкаф для добавления продукта ПЦР раунда 1 в реакцию раунда 2, если проводится вложенная ПЦР. В этой зоне нельзя работать с реагентами для ПЦР и выделенными нуклеиновыми кислотами, поскольку существует высокий риск контаминации. В этой зоне должен быть отдельный комплект перчаток, лабораторные халаты, штативы для планшетов и пробирок, пипетки, наконечники для фильтров, контейнеры и другое оборудование. Перед открытием пробирки необходимо центрифугировать. Рабочее пространство для образцов следует очищать так же, как и пространство для приготовления мастер-микса.
Пост-ПЦР: анализ продукта
В этом помещении размещается оборудование для обнаружения продукта, например, резервуары для гель-электрофореза, блоки питания, УФ-трансиллюминатор и система документирования гелей. В этой зоне должны быть отдельные комплекты перчаток, лабораторные халаты, штативы для планшетов и пробирок, пипетки, наконечники для фильтров, контейнеры и другое оборудование. В эту зону нельзя вносить никакие другие реагенты, за исключением красителя для нанесения, молекулярного маркера, агарозного геля и компонентов буфера. Рабочее пространство для образцов следует очищать так же, как и пространство для приготовления мастер-микса.
Важное примечание
В идеале, не следует заходить в комнаты, где проводится предварительная ПЦР-диагностика, в тот же день, если в комнатах, где проводится пост-ПЦР-диагностика, уже проводились работы. Если это совершенно неизбежно, сначала тщательно вымойте руки и наденьте специальные лабораторные халаты. Лабораторные журналы и документы нельзя проносить в комнаты, где проводится предварительная ПЦР-диагностика, если они использовались в комнатах, где проводится пост-ПЦР-диагностика; при необходимости сделайте дубликаты распечаток протоколов/идентификационных номеров образцов и т. д.
4. Общие советы по молекулярной биологии
Используйте неопудренные перчатки, чтобы избежать ингибирования анализа. Правильная техника пипетирования имеет первостепенное значение для снижения контаминации. Неправильное пипетирование может привести к разбрызгиванию при дозировании жидкостей и образованию аэрозолей. С рекомендациями по правильному пипетированию можно ознакомиться по следующим ссылкам: Руководство Gilson по пипетированию, Видеоролики Anachem по технике пипетирования, Центрифугируйте пробирки перед открытием и открывайте их осторожно, чтобы избежать разбрызгивания. Закрывайте пробирки сразу после использования, чтобы избежать попадания контаминантов.
При проведении нескольких реакций готовьте одну мастер-микс, содержащую общие реагенты (например, воду, dNTP, буфер, праймеры и фермент), чтобы минимизировать количество переносов реагентов и снизить риск контаминации. Рекомендуется готовить мастер-микс на льду или холодном блоке. Использование фермента Hot Start может помочь снизить образование неспецифических продуктов. Защищайте реагенты, содержащие флуоресцентные зонды, от света во избежание деградации.
5. Внутренний контроль
Включайте хорошо охарактеризованные, подтверждённые положительные и отрицательные контроли, а также контроль без матрицы во всех реакциях и многоточечную титрованную линию тренда для количественных реакций. Положительный контроль не должен быть настолько сильным, чтобы представлять риск контаминации. При проведении экстракции нуклеиновых кислот включайте положительные и отрицательные контроли экстракции.
Рекомендуется разместить чёткие инструкции в каждой зоне, чтобы пользователи знали правила поведения. Диагностическим лабораториям, выявляющим очень низкие уровни ДНК или РНК в клинических образцах, рекомендуется принять дополнительные меры безопасности, используя отдельные системы кондиционирования воздуха с небольшим положительным давлением в помещениях для предварительной ПЦР и небольшим отрицательным давлением в помещениях для последующей ПЦР.
Наконец, полезно разработать план обеспечения качества (ОК). Такой план должен включать списки основных и рабочих запасов реагентов, правила хранения наборов и реагентов, отчетность о результатах контроля, программы обучения персонала, алгоритмы устранения неполадок и корректирующие действия при необходимости.
6. Библиография
Аслан А., Кинзельман Дж., Дрилин Э., Ананьева Т., Лавандер Дж. Глава 3: Создание лаборатории количественной ПЦР. Руководство по тестированию рекреационных вод методом количественной ПЦР USEPA 1611. Университет штата Лансинг, Мичиган.
Министерство здравоохранения Англии (NHS). Стандарты Великобритании для микробиологических исследований: Надлежащая лабораторная практика при проведении анализов молекулярной амплификации. Руководство по качеству. 2013;4(4):1–15.
Миффлин Т. Создание ПЦР-лаборатории. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Шредер С. 2013. Регулярное обслуживание центрифуг: очистка, обслуживание и дезинфекция центрифуг, роторов и адаптеров (Технический документ № 14). Гамбург: Eppendorf; 2013.
Виана Р.В., Уоллис К.Л. Надлежащая клиническая лабораторная практика (GCLP) для молекулярных тестов, используемых в диагностических лабораториях. В: Акьяр И., редактор. Широкий спектр контроля качества. Риека, Хорватия: Intech; 2011: 29–52.
Время публикации: 16 июля 2020 г.
